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剧情：马里奥兄弟居住在一个叫布鲁克林的小镇里，他们在经历了修水管失败，被全家人及邻居嘲笑后，看到市中心水管迸发的新闻，就赶紧跑去，认为这是证明他们实力的好机会。
于是就来到了市中心，他们掀开下水管道，找到了打开的闸门，两人就爬向管道想去关闭闸门。不幸的是，闸门损坏，并且管道不结实，他们掉下水中，并阴差阳错的来到了下水管道地下室，里面有着许多管道。这时路易基看到了奇怪的绿色管道，被吸入里面，马里奥看到了路易基的帽子，就进入管道，也被吸入了进去。
这里面是通向两个地方的透明管子，路易基误入了黑暗世界，而马里奥则来到了蘑菇世界。 路易基来到了黑暗王国，在被骷髅乌龟的追赶下，不小心进入了库巴城堡，并被关了起来。而马里奥遇到了红色奇诺比奥，在两人的交谈中，在他的带领下，两人来到蘑菇王国，并要去找碧琪公主去解救路易基。
而公主打听到库巴获得了无敌星，正在商谋如何解决问题，正好看到了被蘑菇守卫追赶的马里奥。而公主为证明马里奥的本事，就带他去王国阳台，按下按钮，一个完整的2D赛道呈现在两人面前。 公主先是示范如何通关，并顺利摸到旗子。而马里奥吃了蘑菇，花了好长时间，由不熟练到熟练，快要到终点时，被花给打掉状态了， （动画电影特有的喜剧幽默） 而公主觉得他的技术已经可以了，于是碧琪公主，马里奥，红色奇诺比奥三人组成的团队将要去远方的森林王国寻求增援。
来到了森林王国，并在大猩猩的带领下参加了王国首领。而王国首领要求马里奥与他的儿子森喜刚决斗，赢了才答应给予增援。
到了决斗场地，马里奥先是被动挨打，又吃错了缩小蘑菇，被打掉状态后被扔向了空中，刚好马里奥被扔向了黄色问号砖块。然后马里奥一顶，是猫形态状态。（记得某主播说过，猫对抗强doge）在猫状态马里奥的攻击下，森喜刚败下阵来，并输了比赛。
国王这才同意增援蘑菇王国，并告诉马里奥同行们，有一条捷径可以通向黑暗王国，并让他们选好卡丁车，走彩虹赛道通向那里。 不巧，他们的行踪被库巴发现了，并派出兵力去扰乱他们。在两者打得有来有回的时候，被蓝色飞行龟壳偷袭，森喜刚和马里奥掉下海里，并被大鱼所吞入口中。而增援们因赛道被炸毁，被库巴的手下带到黑暗王国并关到监狱里。
而公主和红色奇诺比奥险些逃出，并回到蘑菇王国向奇诺比奥们发通告，让他们暂时逃到森林里。 这时库巴驾驶岛屿到蘑菇王国向公主提亲，公主被迫答应。在两人的婚礼之前，红色奇诺比奥给了公主一束鲜花，婚礼当中，库巴向碧琪公主求爱，并拉下关犯人的开关，将作为祭品献礼。此时公主从花束中抽出冰花，并吃下获得冰花状态。把库巴冰冻起来，又冰冻了开关，公主与库巴的手下打了起来。
此时另一边，大鱼又吞下了残破的赛车，被吞下的森喜刚和马里奥借此机会，用赛车上的助推器，飞出了鱼口之中。两人回到被占领的蘑菇王国，一路披荆斩棘，马里奥获得了狸猫状态，（这个状态和猫状态不一样，可以借助狸猫尾巴实现飞行）森喜刚获得了火焰状态。在公主忙于对抗的时候，开关上的冰裂开了，在危急关头，马里奥和森喜刚阻止了开关，并救下了监狱里的犯人们。
就在要大团圆的时候，库巴的冰裂开了，并发令了超级导弹刺客系统，企图通过导弹摧毁蘑菇王国，而马里奥用狸猫状态飞行，并成功激怒了导弹。在马里奥的躲避下，马里奥钻进了绿色管道，而导弹在管道中爆炸了，蘑菇王国和库巴城堡及那些人被吸入布鲁克林世界。
然后库巴恼羞成怒，将马里奥打得处处被动，并扔向了杂货店里，而此时公主一行人拦住了库巴，在马里奥恢复体力的同时，看到了之前马里奥兄弟刊登电视的场面。马里奥恢复了自信心，要去和库巴决战，而森喜刚败下阵来，公主趁机把无敌星打到离马里奥几米的地方。库巴见此状发射火焰向马里奥，此时路易基用下水道盖子挡住了火焰。在两人的协作下，马里奥兄弟吃了无敌星，把库巴军团打得节节败退。并把库巴从天上打向地上，库巴岛屿被摧毁了。在库巴孤军难敌的情况下，公主让库巴吃下缩小蘑菇并关进瓶子里。
马里奥兄弟成为了拯救世界的大英雄，受人欢迎，马里奥兄弟也住在了蘑菇王国，世界恢复了和平呢～
彩蛋一：被关进瓶子里的库巴弹着缩小钢琴并唱着给碧琪公主写的情歌，被奇诺比奥打破了幻想
彩蛋二：在马里奥兄弟们之前误入的地下室里，有一张耀西蛋裂开了